RNAi

Neben unsere Arbeit an molekularen Transportern und der Forschung an in vivo RNAi, versuchen wir auch RNAi- Techniken zu entwickeln, die zu einem knockdown der  mRNA führen, ohne starke Off-target Effekte zu entwickeln. Diese werden für die Untersuchung der Funktion und Verteilung von Membranlipiden und Membranproteinen benötigt. Wir haben eine Vielzahl von permanent transfizierten RNAi- Zelllinien und auch transiente RNAi Methoden entwickelt, die zu einer reduzierten Expression bestimmter Lipide führen. Wir konnten zeigen, dass Glucosylceramid für den Vesikeltransport vom Golgi-Apparat zu den Endosomen essentiell ist. Ebenso konnten wir zeigen, dass Dehydroceramid-Level eine Auswirkung auf den Triglyceridstoffwechsel besitzen. Bis jetzt haben wir RNAi- Zelllinien etabliert, die für die Untersuchung von Clathrin- assoziierten Proteinen eingesetzt werden können, die einen Teil der des Vesikeltransports der Zelle abdecken. Das Herunterregulieren der Expression von Sphingolipiden, den Phosphatidylinositolen PI(3)P, PI(3,4)P2, PI(3,4,5)P3 und PI(3,5)P2, an dem wir gerade arbeiten, zerstört den Membranaufbau aller Zellorganellen. Wir untersuchen mittels biochemischer und zellbiologischer Methoden den Effekt dieser Lipide auf die Zusammensetzung und Verteilung der anderen Membranlipide, die Bildung von Lipid- Mikroclustern, und die Funktion, den Transport und die Lokalisation bestimmter integraler Membranproteine. Zusätzlich entwickeln wir gerade ein ESI-MS/MS Protokoll zur parallelen Detektion der verschiedenen PIPs in Wildtyp – und RNAi Tranfizierten Zellen. Erste Experimente zeigen, dass diese Techniken eine Quantifizierung von PI(3)P aus Zelllysaten möglich machen.
Ein weiterer Baustein dieses Forschungsbereiches ist die Herstellung transgener Mäuse, die durch die  Synthese von permanter RNAi ermöglicht wird. In einer früheren Arbeit konnten wir eine permanente RNAi Phenotypen herstellen, indem wir shRNAs synthetisierten, die einen fast 100%tigen knock down des Proteins erlaubten. Neben Knockdown-Studien an Zelllinien, wird ein transgenes Maus-Modell entwickelt, bei dem die Expression von miRNA durch das Cre/lox – System kontrolliert wird.